实验小站 | 细胞培养方法（十三）慢病毒感染细胞

慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。

所以，在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒己经成为表达外源基因或外源shRNA的常用载体形式之一，并且正在获得越来越广泛的应用。

细胞培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、PBS、青霉素-链霉素溶液、慢病毒、Polybrene助转染试剂

（1）PBS磷酸盐缓冲液：PBS粉剂每袋加ddH2O定容至1000mL，调pH7.2，121℃，30min，高压灭菌，4℃保存备用。

（2）细胞生长培养液：临用前根据需要在培养基中加入10%胎牛血清，再按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 ug/mL，置于4℃冰箱保存。

（1）胰酶消化细胞，无血清培养基重悬，调整细胞密度为0.5~1×105/ml（根据情况酌情调整），每孔200ul细胞悬液接种至24孔板，培养箱培养过夜。次日进行慢病毒感染，此时细胞的融合度约为70%左右。

（2）准备病毒：取出4℃保存的病毒，使用瞬时离心机离心20秒（使病毒完全悬于离心管底部即可）；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。根据实验按照MOI准确计算慢病毒用量，将其稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含有慢病毒的培养基的总体积为最小体积，以期获得最佳的感染效率。

（3）根据预实验确认MOI=100进行后续试验，准确计算好每孔所需病毒原液量。慢病毒使用量=MOI*细胞数目/慢病毒滴度，吸取病毒液加入细胞中，同时加入5ug/mL的Polybrene助转染试剂，以提高感染效率。

注：感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大，所以务必保证加病毒之前，细胞处于良好的生长状态。

（4）混匀后将24孔板放在37℃度培养箱中孵育。

（5）8-12小时以后观察细胞状态。细胞状态与未感染组无明显差异，表明慢病毒对细胞没有明显毒性作用，继续培养，24小时后更换为新鲜培养基。

（6）感染48小时后，荧光显微镜观察荧光表达情况，估计慢病毒感染目的细胞的效率。同时，收集样本进行后续实验检测。

Lentivirus 表达时间较长，但在一般代谢较旺盛的细胞（如293T，BHK21等）上，病毒感染24h后可以观察到GFP 荧光；代谢比较缓慢的细胞（如原代培养细胞，神经干细胞，胚胎干细胞等）GFP 蛋白表达时间较长，感染后72-96h甚至更长时间才可以观察到GFP荧光。感染后的细胞可以连续培养一周，通过观察GFP的表达时间和表达强度来确定Lentivirus 对目的细胞的感染情况。感染后期请根据细胞生长的情况对细胞进行及时换液和传代，以保证细胞良好的生长状态。